作者：吕晓芬博士  伍小春（小C）
单抗药物的发展

1986年，世界上首个单克隆抗体（以下简称单抗）药物——用于治疗器官移植出现的排斥反应的抗cd3单抗OKT3获得美国FDA的上市批准，由此拉开了单抗药物发展的序幕。

经过三十年的快速发展，单抗药物在肿瘤、自身免疫病、心血管疾病等领域取得了较好的治疗效果。由于高特异性、有效性和安全性的特点抗体药物在临床中得到了广泛应用。如今，单抗已成为推动全球生物产业发展的引擎。

单抗结构与功能 
具有多个结构域的抗体大分子跟小分子药物相比非常复杂，其分子结构决定了其功能的多样性和复杂性。

众所周知，一个完整的单克隆抗体包括Fab 段（靶点结合区域）和可结晶区Fc 段。单克隆抗体的Fab段可以结合肿瘤相关抗原，而Fc部分对于IgG分子在细胞水平上的功能和它的代谢途径起重要作用。抗体分子序列和亚型都会对效应功能产生影响。

效应功能包括单抗的Fc区域通过结合主要是NK上的FcγRIII（CD16A）引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCC）。 Fc也能够结合血清补体分子（C1q），继而形成膜攻击复合物（MAC）引发补体依赖的细胞毒作用（CDC）。当Fc区域与巨噬细胞上的FcγRIII（CD16A），FcγRII（CD32A）和FcγRI（CD64）结合，可引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用（ADCP）。(见图1)

图1：单克隆抗体的Fc 区域与FcrRs作用引发的：ADCC,ADCP,CDC

所以体外单抗的生物功能实验能准确的评估一个抗体的效应功能，它是前期抗体研发阶段抗体的筛选和临床前抗体功能的进一步验证以及验证生物类似药与原研药的效价比较的一系列重要方法。下面先介绍ADCC的作用机制和几种方法的操作原理。另CDC和吞噬作用的机制和方法请见下篇分享。

ADCC
ADCC作用是一种细胞介导的免疫防御机制，在靶细胞膜表面抗原结合了特异性的抗体的情况下，激活免疫系统的效应细胞进而裂解靶细胞的作用。经典的ADCC作用由NK细胞介导，中性粒细胞和嗜酸性粒细胞也能介导ADCC作用。

ADCC作用中效应细胞奥浦迈用的是稳转的NK92MI-CD16a(V158),这个突变体与human IgG1具有较强的结合能力。CD16a在第158位氨基酸是一个苯丙氨酸(F)或缬氨酸(V)。这个残基与IgG1的下铰链区直接相互作用，人类的IgG1与纯合的FcγRIIIa-158V自然杀伤细胞(NK)的结合比与纯合的FcγRIIIa-158F或杂合的NK细胞的结合更强。若是人血提取的PBMC作为效应细胞，NK细胞上的CD16a第158位氨基酸则有可能是V或者是F。

体外检测ADCC效应有以下几种方法。
1.1 通过检测乳酸脱氢酶的释放，检测靶细胞的死亡量

此方法利用荧光分析法检测多孔板中死亡细胞的数量。它通过测定损坏的细胞膜中释放出来的乳酸脱氢酶(LDH)。产生的荧光量与裂解的细胞数量成正比。酶学反应对正常的健康细胞无任何损伤，因此检测可在正常细胞与死亡细胞的混合物中完成。这是传统的用于检测ADCC的方法，操作比较简便，但缺点是靶细胞没有被标记，检测结果不能区分靶细胞和效应细胞的LDH释放。

操作过程：准备好靶细胞加入到96孔反应板中，然后再加入按比例稀释好的阳性对照抗体和样品，孵育一定的时间,将准备好的效应细胞(NK92/CD16A细胞或者从血里提取的PBMC)加入到对应孔中孵育一定的时间，孵育完后酶标仪读取荧光，对于不同靶细胞，不同的抗体的LDH检测方法：效应细胞和靶细胞的比例以及孵育时间都需要重新优化。案例结果见图2

图2：LDH法检测细胞杀伤

1.2   BATDA 标记靶细胞，通过检测荧光的强弱，检测靶细胞的死亡数量
此方法是用荧光增强配基-BATDA 标记靶细胞，疏水的配基BATDA能够自由透过细胞膜，进入细胞膜后BATDA被水解形成亲水的配基TDA，不易透过细胞膜。（见图3）当靶细胞被效应细胞裂解后，TDA漏出细胞膜，加入Europium Solution,形成强荧光的稳定金属螯合物：Eu-TDA（见图4）。这是一个时间分辨荧光强度实验，所以需要测TRF（Time-Resolved Fluorescence）。

图3：BATDA 标记细胞及检测原理

图4： BATDA 标记靶细胞及其检测ADCC 的 基本过程

此方法的操作方法与检测乳酸脱氢酶的方法的类似，只是多了一步靶细胞的标记和洗涤的过程。
此方法的优点是灵敏度高，荧光信号稳定，非放射性，缺点是操作比较复杂，由于标记靶细胞会对细胞有一定毒性，对于一些比较敏感的靶细胞被标记后发生大量自我死亡。对检测杀伤产生影响。
此方法需要优化的条件：不同靶细胞BATDA 标记的时间，不同靶细胞标记所需要的BATDA的浓度；不同靶细胞不同抗体：效应细胞和靶细胞（NK92细胞或者PBMC）的比例，效应细胞与靶细胞，抗体的孵育时间需要优化。图5和图6都是BATDA 标记靶细胞检测ADCC的结果，图5效应细胞是NK92/CD16A，图6效应细胞是新鲜的 PBMC 

图5： BATDA 标记靶细胞检测ADCC,效应细胞为NK92/CD16A 
图6： BATDA 标记靶细胞检测ADCC,效应细胞为PBMC

1.3   Calcein-AM 标记靶细胞，通过检测荧光的强弱，检测靶细胞的死亡数量
Calcein-AM 也是一种对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，它在Calcein(钙黄绿素)基础上引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增加了疏水性，使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM(本身不发荧光)被细胞内的酯酶剪切形成膜非渗透性的极性分子Calcein,从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。(图7)。Calcein 标记后可以用两种方法检测杀伤效果，一种是Calcein-AM release assay,用酶标仪读取死亡细胞释放至上清的荧光量即靶细胞的死亡量；另一种是 Calcein-AM retention assay,用流式细胞仪检测滞留在靶细胞内的Calcein 绿色荧光信号的强弱从而检测活细胞的数量。

1.3.1 Calcein-AM release assay,用Calcein-AM标记靶细胞后，加入抗体和效应细胞，孵育一定时间，用酶标仪读取荧光。每个细胞不同的抗体,效应细胞和靶细胞的比例以及孵育时间都需要重新优化。此方法的优缺点以及需要优化的条件同BATDA 标记靶细胞的方法一样。图８ Calcein-AM release assay 检测 ADCC

图7：Calcein AM 标记靶细胞的原理


图8 Calcein-AM release assay 检测ADCC

1.3.2  Calcein AM retention assay

Calcein AM retention assay 前期的标记靶细胞及与抗体效应细胞的孵育的操作同release assay一样， 只是最后通过流式细胞仪检测。操作步骤见图9，图10是 retention assay 检测结果图。


图9 Calcein AM retention assay 操作流程

图10：Retention assay ADCC 结果

A:不含抗体孔Calcein AM 阳性的靶细胞，B:含抗体孔Calcein AM 阳性的靶细胞
Cell death X(%)=(100-Number of Calcein  positive live cellls in X/Number of Calcein positive cells in control)*100
“Number of Calcein  positive live cells in X”:含抗体孔Calcein AM 阳性的靶细胞数
“Number of Calcein positive cells in control”:不含抗体孔Calcein AM 阳性的靶细胞数，这个样品被认为是100%活细胞
根据公式得出：%Cell death=(1-0.798/2.61)*100=69.5%

1.4  ADCC 报告基因生物活性检测
ADCC报告基因生物活性检测即ADCC Reporter assay，它的操作过程和前面提到的几种ADCC的方法一样。待检测的抗体和表达相应靶点的靶细胞结合。然而在检测报告基因的实验里，需要用到工程T淋巴细胞-表达FcRIIIa 受体的Jurkat 细胞而不是NK细胞（图11）。报告基因检测法的优点是,效应细胞Jurkat 细胞培养简单，实验程序操作简单，实验稳定性好，背景低等。缺点是它不是模拟体内ADCC作用过程，此方法可以用作前期的抗体筛选阶段，但是到后期确定抗体功能，还是需要效应细胞为Fresh PBMC的方法，更能模拟人体内ADCC作用过程。在这个过程中， Fc段与Jurkat 细胞上的FcRIIIa受体结合，FcRIIIa受体的活化能够引起nuclear factor of activated T-cell(NFAT)信号通路的活化，启动荧光素酶报告基因的表达。一旦靶细胞被裂解，荧光素酶和荧光素和ATP相互反应，产生一种稳定光信号。这个实验是一个"加样-混合-读数"的检测模式极大减少了操作步骤，不需要离心和转板。


图11 ADCC  Reporter  bioassay 原理

参考文献
1.   M.A. Gillissen , E.Yasuda, G. de Jong, S.E. Levie, D. Go, H. Spits, P.M.vanHelden,M.D. Hazenberg ,The modified FACS calcein AM retention assay: A high throughput flow cytometer based method to measure cytotoxicity，J. Immunol. Methods (2016)
2.  Josée Golay, Martino Introna，Mechanism of action of therapeutic monoclonal antibodies: Promises and pitfalls of in vitro and in vivo assays，Archives of Biochemistry and Biophysics 526 (2012) 146–153

3．Automated Non-Radioactive Assay Methods For ADCC and CDC Assays，BioTek Instruments

4.  Xin Wang, Zhiqiang An, Wenxin Luo, Ningshao Xia Qinjian Zhao，Molecular and    functional analysis of monoclonal antibodies in support of biologics development Protein Cell，DOI 10.1007/s13238-017-0447-x

5.  Gregory P Adams & Louis M Weiner，Monoclonal antibody therapy of cancer Nature Biotechnology, 23(9), 1147–1157. doi:10.1038/nbt1137

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